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详细|病毒采样管灭活效果试验方法介绍
发布时间:2023-02-01 96

  根据《医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册(试行第二版)》通知,“人群筛查应选择具有病毒灭活功能,如含胍盐(异硫氰酸胍或盐酸胍等)或表面活性剂的采样管。”


  灭活型病毒采样管可高效灭活病毒,保护病毒核酸不被降解,且能在常温下保存较长时间,为样品保存及运输节省成本。选择灭活效果好的病毒采样管,有助于确保后续核酸检测质量。



  病毒采样管灭活效果试验方法


  参考《消毒技术规范》(2002版)病毒灭活试验中描述的检测方法,确定病毒保存管灭活能力。


  步骤一:细胞培养


  将生长状态良好的HEK293T细胞消化计数后稀释至1×104/mL,按照100μL/孔的体积,每个梯度的病毒做三个复孔,计算所需接种孔数,将细胞缓慢均匀接种至96孔板中。放入37℃,5%CO2培养箱中培养过夜。


  步骤二:慢病毒稀释


  将病毒滴度为107-108TU/mL的慢病毒按10倍梯度进行稀释,连续稀释3个梯度。


  步骤三:病毒灭活


  把稀释好的病毒置于室温条件下,与灭活款病毒保存液(批号:220201/220207/220211)按1:1体积比进行混合,置于室温下分别放置1min、5min和10 min进行灭活。


  步骤四:终止灭活


  采用病毒分离培养基(可用DMEM完全培养基替代)进行1000倍稀释以中和灭活保存液,终止灭活。


  阴性对照:为病毒分离培养基对灭活款病毒保存液稀释1000倍的混合液;


  阳性对照:为病毒分离培养基对病毒原液稀释1000倍的混合液。


  步骤五:病毒孵育


  将事先培养的HEK293T细胞中吸弃细胞培养基,每孔加入100μL准备好的病毒混合液,和对应的阳性对照、阴性对照。病毒孵育3小时,每隔30分钟从培养箱中取出晃动一次。


  步骤六:细胞培养


  孵育结束后,将病毒液吸去,每孔中加入100μL DMEM完全培养基,将96孔板置于37℃,5% CO2培养箱中培养,并观察细胞状态。


  步骤七:荧光细胞观察与计数


  继续培养48-72h,期间观察细胞状态,若细胞培养液变黄,应换液,对荧光细胞个数适量的孔进行计数,计算病毒滴度。


  中科检测提供病毒采样管检测服务,包括病毒采样管灭活效果试验,为企业与原料厂商提供技术支撑,为社会防疫物资供应提供保障。

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