抗菌剂指能够在一定时间内,使某些微生物(细菌、真菌、酵母菌、藻类及病毒等)的生长或繁殖保持在必要水平以下的化学物质。抗菌剂抗菌性能的好与否可以从两方面来判断即各文献中分类的抑菌作用(即静菌力)与杀菌作用(即杀菌力)。因此,抗菌剂抗菌性能传统检测方法中,包括静菌力评价与杀菌力评价两方面的内容。
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抗菌剂抗菌性能检测:静菌力
(1)静菌力大多数情况下采用电导率法或者 MIC 法来评价。
电导率法:在不补充营养液的情况下,细菌在生长过程中,会逐步消耗营养液中的蛋白质,提取其所需的物质而放出有机酸和氨基酸两种电解质。因此,细菌生长越快,由于没有外来营养物质的加入,营养液中电解质浓度就越大,其导电性也越好,电导率也就越大。将没有加入抗菌剂的营养液作为参照物,一定时间内,对比加入抗菌剂营养液电导率的变化趋势,能够有效地反应抑菌作用的大小。
MIC法:MIC是指使阻碍细菌发育所需的抗菌剂的最小浓度。MIC值越小,抗菌剂的静菌活性越大,即表示抗菌剂的抑菌作用越好。MIC测定有两种方法,其一是液体稀释法。取一没有接种细菌的空白营养液作为参照物,使用营养液连续稀释抗菌剂,将细菌接种到已稀释抗菌剂的营养液,观察营养液的浑浊情况。当出现与空白营养液透明度相当的浓度时,此时抗菌剂的浓度即为其MIC值。二是固体稀释法,也叫培养基法。先倾倒培养基,然后将混有不同浓度抗菌剂的细液体涂布到培养基上,恒温下放置一天,观察开始没有细菌生长的最小浓度即为其MIC值。
抗菌剂抗菌性能检测:杀菌力
杀菌力可以用直接计数、灭菌率和抑菌圈三种方法来评价,在各方法的测定检测时,因为抗菌材料形态与检测操作的不同,所以检测手段也会有很多种。
试验中常用的也是最直观表现杀菌性能的就是抑菌圈指标-抑菌环法。激活细菌,使其达到对数期,此时用灭菌生理盐水调节其浓度到108个ml,然后与营养液混合,倾倒在培养皿中,一同固化成试验平板,把实验所需的抗菌剂加工成圆盘,紧贴平板置于平板中央。37℃下培养18h后,在圆盘的周围会出现没有细菌生长的空白圆环(抑菌圈),测量抑菌圈直径的大小,与标准圆坏对比,评价抗菌材料杀菌力。
抗菌剂抗菌性能检测:操作步骤
本实验分别采用抑菌圈法和 MIC法来表征样品的杀菌力和静菌力。
将已高温灭菌的 LB 琼脂培养基加热到完全融化,快速的倒在培养皿内,每个培养皿 15ml,待其完全凝固。此外,将融化的LB 琼脂培养基冷却到50℃左右(温度不可过高,会杀死细菌,又不可过低,要不然培养基将重新凝固)混入试验菌,将混有菌的培养基5ml加到已凝固的培养基上待凝固(上层)。
在无菌操作环境下,在混合培养基表面直接垂直放上牛津杯(内径6mm、外径 8mm、高10 mm 的圆形小管,已高温灭菌),轻轻加压,使其与培养基紧密接触,在牛津杯中加入待检抗菌剂样品,牛津杯一般情况下可以装240微升,勿使其外溢。加满后置37℃培养16-18小时,观察结果,抑菌用尺直接量就可以。在培养中,一方面试验菌开始生长,另一方面抗生素呈球面扩散,离杯越近,抗生素浓度越大,离杯越远抗生素浓度越小。随着抗生素浓度减小,有一条最低抑菌浓度带,在带范围内,菌不能生长,而呈透明的圆圈,这就叫“抑菌圈”。抗生素浓度越高,抑菌圈越大。
本实验采用培养基法来测定其最小抑菌浓度。